Šta je molekularna ampelografija

Naslov orginala: Qu’est-ce que l’ampélographie moléculaire? (What is molecular ampelography?). Izvor: https://www.vignevin.com/; Objavljeno: 06.05.2019. by Olivier Yobrégat. Prevod: Dragutin Mijatović. Ključne riječi: vinova loza, DNK, ampelografija

Savremene tehnike genotipizacija i analiza DNK revolucionirale su ampelografiju. Omogućuju razlikovanje velikih skupina unutar vrste Vitis vinifera i razlikovanje sorti bez čekanja na razvoj biljaka. Izraz ampelografija dolazi od grčkog “ampelos” što znači vinova loza i “pravopis” koji se odnosi na opis. Predložen prvi put 1661. godine od strane doktora Sachsa u knjizi Ampelographia, ovaj termin sada uključuje i opis i identifikaciju sorti grožđa, proučavanje njihove evolucije i odnosa koji postoje među njima i saznanja o njihovom ponašanju prema okolini (kulturne i enološke vještine). Dugo vremena se ampelografija temeljila samo na vizuelnom promatranju vinove loze, osobito na morfologiji lista, lastara i grozda. Među stotinu deskriptora kodiranih da opisuju različite organe loze, OIV je odabrao 14 primarnih deskriptora zbog svoje dobre diskriminirajuće moći između sorti. U novije vrijeme ampelografija je stekla nove alate kao što su hemotaksonomija (ispitivanja spojeva sekundarnog metabolizma) ili biohemijski markeri (isozymes). Prava revolucija nastala je ugradnjom u genetsku ampelografiju 1990-ih. Molekularno označavanje i sekvencioniranje DNK omogućili su pristup ne samo fenotipu, već i direktno genotipu, u ranoj fazi bez potrebe da se čeka potpuni razvoj biljke. DNK potreban za ovu vrstu analize može se izdvojiti iz nekoliko desetina miligrama biljnog materijala i iz bilo kojeg organa ili dijela biljke (list, bobica, lastar, korijen itd.)

Šta je DNK i kako je građena? Deoksiribonukleinska kiselina, odnosno DNK, molekul je koji se nalazi u svim živim ćelijama i sadrži sve informacije neophodne za razvoj i funkcionisanje organizma. Podržava i nasljednost jer se prenosi tokom reprodukcije, bilo da je integralna ili ne. Stoga nosi genetske informacije i sačinjava genom živih bića. DNK određuje sintezu proteina, putem RNA. Ova dvostruka spirala sastavljena je od nukleotidnih sekvenci sastavljenih od fosfatne skupine povezane sa šećerom, deoksiribozom, koja je sama povezana sa azotnom bazom. Postoje četiri različite azotne baze uključujući citozin (C) i timin (T) iz porodice pirimidina te adenin (A) i guanin (G) iz porodice purina. U biljnim ćelijama DNK je lokalizirana u jezgru i u hloroplastima. Hloroplasti su esencijalne organele koje pomažu u hvatanju svjetlosti koje uzrokuje fotosintezu.

Koje tehnike koristi molekularna ampelografija? Molekularna ampelografija zahtijeva analizu nekoliko vrsta markera na DNK, koje omogućavaju diferencijaciju sa sigurnošću:

  • mikrosateliti (jedro i hloroplasti) ili SSR- Simple Sequence Repeats (jednostavna ponavljanja sekvence): Ovo su kratke DNK sekvence formirane iz ponavljanja (do 20 do 30 puta) jedinica od 2,3 ili 4 baze (na primjeru CA ili GAT).
  • indeksi koji su umetanje ili brisanje mutacija kratkih DNK sekvenci
  • prenosivi elementi ili pokretni elementi koji se ponekad nazivaju i „skačućim genima“. Njihovi pokreti mogu se aktivirati stresom i određenim faktorima okruženja. Mobilnost ovih elemenata izvor je mutacija, dakle genetske varijabilnosti i evolucije. Razlikuje se retrotransposoni koji se širi u režimu „kopiraj i zalijepi“ i transpozoni koji se kreću „reži i zalijepi“.
  • polimorfizmi sa jednim nukleotidom ili SNP (Single Nucleotid Polymorphism) koji se odnose na samo jedan nukleotid. To je promjena iz jedne baze u drugu. Razlikuje se između tranzicija koje su nukleotidne supstitucije unutar iste porodice (purin ili pirimidin) i transverzija, promjena iz purina u pirimidin ili obrnuto.

Šta je molekularna ampelografija naučila o porijeklu loze? Rad koji je objavio tim Jean-Pierre Péros-a (INRA-e Montpellier) pokazuje da je nasljedni karakter azijskih vrsta vinove loze mogao istovremeno biti i porijeklo evropske vrste Vitis vinifera i američkih vrsta. U vezi sa posljednjim, dogodila su se dva odvojena širenja loze iz Evroazije u Ameriku: prvi, slučaj porijekla središnjih i istočnih vrsta (Vitis labrusca, Vitis riparia, Vitis rupestris i Vitis berlandieri), drugi porijeklo kalifornijskih vrsta (Vitis californica). Analiza mikrosatelita omogućila je i razlikovanje pravih evropskih divljih loza (Vitis vinifera subsp. sylvestris) poznatim i pod imenom lambrusques. Unutar ovog kultivisanog odjeljka ove su analize omogućile objektivnu raspodjelu sorti u pet glavnih geografskih skupina u odnosu na njihove karakteristike.

Šta je molekularna ampelografija naučila o porodičnim vezama sorti grožđa? Analiza mikro satelita od 2.300 tradicionalnih sorti grožđa čuvanih u Domaine de Vassal (INRA u Marseillanu) omogućila je formiranje cjelovite i jedinstvene baze podataka. Kad se proučava set markera sorte, mogu se uporediti dvije druge sorte grožđa, jer svaka ima polovinu utvrđenih vrijednosti, velika je vjerovatnoća da je ukrštanjem ove dvije sorte grožđa dobijena treća. Čak se ponekad može odrediti ko je otac, sorta davalac polena i koja je sorta majka dala plod. Doista, to je majka koja budućeg potomka opskrbljuje svom svojom “metaboličkom mašinerijom”, posebno hloroplastima gdje se nalazi i DNK na kojoj su determinisani određeni genetski markeri.

Tako se pokazalo da je Gouais Blanc, bijela sorta sa malim enološkim interesom, važan dio naših današnjih sorti grožđa. Na primjer, ukrštanjem sa sortom Pinot dobijena je sorta Chardonnay Blanc, Aligoté Blanc, Auxerrois Blnac, Melon Blanc i Gamay Noir. Sa drugim često nepoznatim roditeljima potiču i sorte između ostalih Jacquère Blanc, Grolleau Noir, Colombard Blanc, Riesling Blanc ili čak Saint-Côme Blanc aveyronnais (Aveyron).

U novije vreme, studija Jean-Michela Boursiquot i drugih saradnika objavljena krajem 2008. u australijskom naučnom časopisu omogućila je identifikaciju srodstva sorte Merlot Noir. Tokom istraživanja izvršenih na starim parcelama vinove loze u području Brettany i Charentes identifikovana je originalna i nepoznata sorta grožđa: Magdeleine noire des Charentes. Analize su potvrdile da je ta vrlo stara sorta grožđa majka sorte Merlot Noir i Cot Noir (Malbec). Znali smo i da su Prunelard Noir i Malbec povezani, ne znajući značenje roditeljstva. Sada znamo da je Prunelard Noir otac sorte Malbec.

Koji su najznačajniji primjeri uspješne sortne identifikacije pomoću molekularne ampelografije? Godine 2009., Jean-Michel Boursiquot i Laurent Audeguin iz Plant Material Pole IFV-a uspjeli su označiti lažnu sortu Albarinho Blanc tokom misije za Australiju. Dugi niz godina, lokalni vinogradari vjerovali su da uzgajaju ovu sortu koja potiče iz zapadnog dijela Iberijskog poluotoka, ali brzo su naše kolege utvrdile da je to ustvari sorta Savagnin Blanc. Taj je rezultat potvrđen ubrzo nakon njihovog povratka u Francusku, zahvaljujući genetskoj analizi DNK-a uzetom na licu mjesta i nakon uporedbe sa postojećim bazama podataka (IFV, INRA). Ista priča se već dogodila u Čileu prije gotovo dvadeset godina i mnogo prije upotrebe genetskih markera. Carmenère Noir vinogradari su dugo vremena brkali sa sortom Merlot Noir. U istom region su ove tehnike omogućile IFV Sud-Ouest da identifikuju sve stare sorte koje se čuvaju u regionalnim konzervatorijumima i sada se uvede u originalne kolekcije sorti grožđa jer tamo nisu bile, poput sorti Moural Noir, Aveyron, Bouysselet Blanc de Fronton i drugih sorte do danas bez naziva…

Da li molekularna ampelografija razlikuje klonove? U ovom trenutku, molekularna ampelografija ne omogućava razlikovanje klonova iste sorte grožđa, jer je vrlo mala intra-sortna razlika na nivou mikro satelita. Međutim, nove metode sekvenciranja vrlo visoke propusne DNK sada omogućuju razmatranje resekcioniranja genoma različitih jedinki. Ovaj pristup je odabran kako bi se pokušale otkriti genetske razlike koje mogu postojati između klonova. Tokom teze koju je Grégory Carrier vodio u okviru UMT Géno-Vigne®, a pod nadzorom IFV-a, Montpellier SupAgro i INRA, analizirana su tri klona sorte Pinot Noir. Rezultati su omogućili istaknuti važnu ulogu pokretnih elemenata (retro-transpozona) u genetskom polimorfizmu otkrivenom između ovih klonova. Na temelju toga, preliminarna analiza raznolikosti pomoću SSAP markera omogućila je dobijanje jedinstvenih profila za sve Pinot Noir klonove u kolekciji. Međutim, odabir ovih markera i validacija njihove stabilnosti i ponovljivosti još uvijek se moraju provjeriti prije nego što se pouzdano identifikuju različiti klonovi.